Biopelículas microbianas como fotoconductores vivos debido a la transferencia ultrarrápida de electrones en nanocables de citocromo OmcS

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5150 (2022) Citar este artículo

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La transferencia de electrones microbianos inducida por la luz tiene potencial para la producción eficiente de productos químicos de valor agregado, biocombustibles y materiales biodegradables debido a las rutas metabólicas diversificadas. Sin embargo, la mayoría de los microbios carecen de proteínas fotoactivas y requieren fotosensibilizadores sintéticos que sufren fotocorrosión, fotodegradación, citotoxicidad y generación de radicales fotoexcitados que son dañinos para las células, lo que limita gravemente el rendimiento catalítico. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de materiales fotoconductores biocompatibles para una interfaz electrónica eficiente entre microbios y electrodos. Aquí mostramos que las biopelículas vivas de Geobacter sulfurreducens utilizan nanocables de citocromo OmcS como fotoconductores intrínsecos. La microscopía de fuerza atómica fotoconductora muestra un aumento de hasta 100 veces en la fotocorriente en nanocables individuales purificados. Las fotocorrientes responden rápidamente (<100 ms) a la excitación y persisten de forma reversible durante horas. La espectroscopia de absorción transitoria de femtosegundos y las simulaciones de dinámica cuántica revelan una transferencia de electrones ultrarrápida (~200 fs) entre hemos de nanocables tras la fotoexcitación, lo que mejora la densidad y la movilidad de los portadores. Nuestro trabajo revela una nueva clase de fotoconductores naturales para la catálisis de células completas.

Se han incorporado células vivas con puntos cuánticos y nanoestructuras para el etiquetado fluorescente y la administración de fármacos durante más de dos décadas1. Sin embargo, las nanoestructuras absorbentes de luz no se han utilizado para impulsar reacciones catalíticas dentro de las células debido a la falta de biocompatibilidad y la alta citotoxicidad de materiales extraños, como fotosensibilizadores, dentro de la célula, lo que a menudo limita la eficiencia operativa1. Además, los defectos inherentes a los fotosensibilizadores sintéticos causan varios problemas, como la fotocorrosión, la fotodegradación y la generación de radicales fotoexcitados, lo que da como resultado una baja estabilidad, irreproducibilidad y falta de sostenibilidad de los materiales biohíbridos2.

Algunas bacterias producen centros de absorción de luz pero sufren de baja eficiencia de transferencia de electrones y falta de durabilidad1. Las proteínas de transferencia de electrones naturales, como las azurinas, la mioglobina y los citocromos de tipo c, no muestran fotoconductividad3,4 debido a la vida útil de los portadores de picosegundos del hierro hemo, que típicamente inhibe cualquier separación de carga5. La unión covalente de fotosensibilizadores artificiales a estas proteínas produce una tasa de transferencia de electrones baja en la escala de tiempo de 10 ns o más lenta, lo que limita en gran medida sus aplicaciones6. Además, no es factible usar tiempos de vida de estado excitado más prolongados, como la inyección de electrones desde los estados de triplete debido a la rápida degradación causada por las especies reactivas de oxígeno producidas en estos procesos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos biomateriales capaces de una transferencia de electrones primarios ultrarrápida para lograr una separación de carga eficiente, seguida de una transferencia secuencial de electrones secundarios para una separación de carga de larga duración y acumulación de carga6.

Para evaluar el uso de materiales vivos modificados como fotoconductores vivos, elegimos el organismo electroactivo del suelo Geobacter sulfurreducens porque ha desarrollado la capacidad de exportar electrones, derivados del metabolismo, a aceptores extracelulares como óxidos metálicos y electrodos en un proceso llamado transferencia extracelular de electrones. (EET)7,8. Las bacterias establecen contacto eléctrico directo con los aceptores de electrones a través de nanocables de citocromo polimerizado de un micrómetro de largo, llamados OmcS, que elimina la necesidad de mediadores redox difusivos7,8 (Fig. 1b). Los hemos en el nanocable OmcS forman un par paralelo apilado con deslizamiento con cada par perpendicular (apilado en T) al siguiente par, formando una cadena continua en toda la longitud micrométrica del nanocable7 (Fig. 1d). Las distancias mínimas de borde a borde son de 3,4 a 4,1 Å entre los hemos apilados en paralelo y de 5,4 a 6,1 Å entre los pares apilados en T.

un esquema de medida. Las biopelículas se cultivan en electrodos transparentes de óxido de estaño dopado con flúor (FTO). b Microscopía electrónica de transmisión de células CL-1 que producen nanocables OmcS. Barra de escala, 200 nm. c Imagen de altura AFM de un solo nanocable OmcS en mica (izquierda) y perfil de altura respectivo (derecha) que se muestra donde se indica la línea roja. Barra de escala 50 nm. d Hemes en OmcS se apilan sin problemas en toda la longitud micrométrica de los nanocables. Las distancias de borde a borde están en Å. e Espectroscopia UV-Visible de biopelícula en electrodo FTO con la longitud de onda de excitación de 408 nm marcada como un triángulo púrpura. f Respuesta de voltaje actual de la biopelícula con el láser encendido y apagado. El aumento porcentual en el valor de la conductancia representa la media ± desviación estándar (DE). de dos réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Debido a esta estructura de nanocables OmcS optimizada evolutivamente con un apilamiento continuo de hemos, G. sulfurreducens puede transferir electrones a distancias de cien veces su tamaño formando redes de nanocables altamente conductivos de más de 100 µm de espesor en biopelículas9,10, lo que permite a G. celdas sulfurreducens para generar la mayor densidad de corriente en sistemas bioelectroquímicos11. Debido a la gran capacidad de almacenamiento de electrones, los citocromos también confieren una alta supercapacitancia a las biopelículas con baja autodescarga y carga/descarga reversible12. Además, una red de nanocables purificados puede transferir electrones a distancias de 10 000 veces el tamaño de una celda9. Por lo tanto, G. sulfurreducens sirve como un sistema modelo ideal para electrocatálisis, corrosión de metales y producción de combustibles13,14. Anteriormente se pensaba que los filamentos conductores en la superficie de G. sulfurreducens son pili15 y una red de pili confiere conductividad a las biopelículas de G. sulfurreducens10,13,16. Sin embargo, los estudios de localización estructural, funcional y subcelular revelaron que los nanocables en la superficie bacteriana están compuestos de citocromos7,8 mientras que los pelos permanecen dentro de la célula durante la EET y son necesarios para la secreción de nanocables de citocromo a la superficie bacteriana17,18.

Los nanocables podrían estar muy extendidos y sus propiedades fotofísicas podrían ser fisiológicamente importantes porque muchas bacterias reductoras de metales similares a Geobacter forman biopelículas altamente conductoras19,20 y están ampliamente distribuidas en la superficie de la tierra en sedimentos poco profundos que contienen abundante luz solar y óxidos metálicos21,22,23 . Los sedimentos son capaces de transportar electrones a lo largo de centímetros24 y pueden convertir la luz incidente en electricidad25. Se ha demostrado que iluminar con luz visible las células de G. sulfurreducens mejora su rendimiento catalítico, como aumentos en la transferencia metabólica de electrones a óxidos metálicos26 u otros materiales semiconductores, en más de 8 veces en comparación con lo observado en condiciones de oscuridad21. Además, la transferencia de electrones bacterianos inducida por la luz se correlacionó bien con las tasas de respiración microbiana y el consumo de sustrato26. Sin embargo, el mecanismo molecular y físico subyacente para este mayor rendimiento fotocatalítico sigue sin estar claro.

Además de la catálisis de células completas inducida por la luz21,26, la expresión artificial del citocromo OmcS en cianobacterias fotosintéticas aumentó el rendimiento catalítico en diversos procesos, como un aumento de 9 veces en la fotocorriente27, un aumento de 13 veces en la fijación de nitrógeno28 y una fotosíntesis mejorada debido al aumento del 60 % en la biomasa29 en comparación con las cianobacterias de tipo salvaje. Estos estudios destacan el papel vital de OmcS en la biocatálisis impulsada por la luz. Sin embargo, no se han investigado las propiedades fotofísicas intrínsecas de OmcS, que podrían explicar estas mejoras catalíticas.

De 111 citocromos en G. sulfurreducens, OmcS es el único citocromo formador de nanocables esencial para EET a óxidos de Fe (III) abundantes en el subsuelo14. De hecho, los citocromos abundantes en el subsuelo durante la biorremediación de uranio funcionan de manera similar a OmcS30. OmcS también es importante para el EET en los electrodos durante las etapas iniciales del crecimiento de la biopelícula14. También se requiere OmcS para la transferencia de electrones entre especies en cocultivos de Geobacter para llevar a cabo la "sintrofia eléctrica"13,31,32. Esta transferencia de electrones entre especies a través de consorcios microbianos naturalmente conductores es importante en diversos entornos metanogénicos y consumidores de metano que afectan el clima global33,34,35. También se ha demostrado que las especies bacterianas fotosintéticas realizan una sintrofia eléctrica con conversión de CO2 impulsada por la luz en productos químicos de valor agregado2. Sin embargo, los componentes y las vías responsables de tal biocatálisis impulsada por la luz no se han identificado y el potencial de fotoactividad más allá de los microorganismos fotosintéticos sigue siendo en gran parte desconocido.

Presumimos que los nanocables de citocromo en las biopelículas podrían ser fotoactivos, lo que permitiría una interfaz electrónica eficiente entre los microbios y los electrodos. Aquí mostramos que las biopelículas vivas de Geobacter sulfurreducens utilizan nanocables de citocromo OmcS como fotoconductores intrínsecos. Sorprendentemente, los nanocables muestran fotoconductividad con transferencia de electrones de hemo a hemo ultrarrápida en subpicosegundos, lo que podría explicar su influencia en el rendimiento fotocatalítico mencionado anteriormente. Estas tasas se encuentran entre las más altas para la transferencia de electrones en estado excitado en biología36.

Para determinar el papel de los nanocables OmcS en la transferencia de electrones inducida por la luz, utilizamos la cepa CL-1 de G. sulfurreducens modificada genéticamente porque sobreexpresa los nanocables OmcS (Fig. 1b-d) y forma biopelículas altamente conductivas y cohesivas que se pueden transferir fácilmente. a múltiples superficies37 (Fig. 1a). Tras la fotoexcitación con láser (λ = 408 nm), que es específica de la banda de Soret de hemos de tipo c4, la conductancia del biofilm permaneció óhmica y aumentó en un 72 ± 21% (Fig. 1e, f). Estos estudios muestran que las biopelículas vivas de G. sulfurreducens pueden servir como fotoconductores intrínsecos. Dado que la conductividad del biofilm determina la tasa bacteriana de EET11, nuestros resultados podrían explicar el mayor rendimiento fotocatalítico de G. sulfurreducens21,26.

Para determinar el origen de la fotoconductividad en biopelículas, purificamos nanocables de la cepa CL-1 (Fig. 2a). El espectro de absorbancia ultravioleta-visible (UV-Vis) de los nanocables mostró una fuerte banda de Soret a 410 nm para los nanocables oxidados por aire (Fig. 2b). Los nanocables se oxidaron por completo en estas condiciones porque la adición de oxidante (ferricianuro) no cambió el espectro (Fig. 1a complementaria). Colocamos los nanocables en electrodos de oro interdigitados e iluminamos desde la parte superior (Potencia del láser = 100 mW/cm2). La fotoconductancia de la red de nanocables inicialmente aumentó más de 6 veces (Fig. 2c), pero el grado de aumento de la conductancia disminuyó con el tiempo, probablemente debido al daño del láser. Los nanocables respondieron más rápido que 100 ms (recuadro de la Fig. 2c). La fotorrespuesta persistió durante horas pero disminuyó con el tiempo (Fig. 2c). Tanto la corriente oscura como la fotocorriente fueron proporcionales a un voltaje aplicado que osciló entre -0,2 y +0,2 V (Fig. 2d), lo que indica un comportamiento de conducción óhmica de los nanocables similar a las biopelículas. Sorprendentemente, las redes de nanocables, con y sin excitación láser, mostraron una respuesta lineal de corriente-voltaje con un aumento de conductancia promedio de 230 ± 28 % (n = 7), que es mayor que las perovskitas comunes38,39 y los nanocables de porfirina40 (Fig. 2d, mi).

un gel de tinción Heme de nanocables que muestra una sola banda de OmcS. b Espectro UV-Vis de nanocables oxidados (verde) y reducidos (rojo). c Respuesta de fotocorriente de la red de nanocables a 200 mV con el decaimiento actual del estado apagado restado. Recuadro: Fotorrespuesta rápida (<100 ms) de nanocables. Los ejes son los mismos que en la Fig. 2c. d Respuesta de corriente-voltaje de la red de nanocables y el citocromo c para comparación e Comparación de la conductancia de la red de nanocables con el láser encendido o apagado. Los valores representan la media ± error estándar de la media (SEM) con puntos de datos individuales que se muestran como puntos grises (n = 7 experimentos independientes). ** indica un valor de p = 0,003 usando una prueba t de dos colas pareadas. f Esquema de pc-AFM de nanocables individuales. g Respuesta de corriente-voltaje de un nanocable individual con un ajuste lineal que se muestra con una línea discontinua púrpura. h Comparación del aumento de la conductancia tras la fotoexcitación en nanocables individuales. Los valores representan la media de todas las curvas de corriente-voltaje medidas en nanocables individuales (el número de curvas oscila entre 10 y 120, Tabla 2 complementaria). i Comparación de la conductancia promedio de nanocables individuales con láser encendido o apagado. Los valores representan la media ± SEM con puntos de datos individuales que se muestran como puntos grises (n = 15 experimentos independientes). ** indica un valor de p = 0,007 usando una prueba t de dos colas pareadas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Múltiples experimentos de control confirmaron que la fotoconductividad observada es una propiedad intrínseca de los nanocables, debido a su arquitectura de citocromo polimerizado. Por ejemplo, el citocromo-c monomérico de corazón de caballo mostró una corriente oscura y una fotocorriente muy bajas como se esperaba3,4 cuando se midió en condiciones idénticas (Fig. 2d). Tras la adición de un ditionito de sodio reductor químico, la banda de Soret para nanocables reducidos se desplazó al rojo a 420 nm como se esperaba4 (Fig. 2b). Estos nanocables reducidos químicamente (λSoret = 420 nm) no mostraron una fotoconductancia significativa tras la excitación a λ = 405 nm, lo que confirma que la fotorreducción de los hemo oxidados es necesaria para la fotoconductividad en nanocables en esta excitación (Fig. 1b complementaria). Cambiar el material del electrodo de oro a tungsteno también retuvo la fotoconductividad, lo que confirma que la respuesta medida no es un artefacto del material del electrodo (Fig. 2 complementaria). La relación de corriente de láser encendido/láser apagado (encendido/apagado) de los nanocables aumentó con el aumento de la potencia del láser, lo que demuestra aún más que la fotoconductividad medida se debe únicamente a la excitación del láser (Fig. 3 complementaria). Todos estos experimentos juntos confirman que los nanocables muestran una fotoconductividad intrínseca que puede explicar la fotoconductividad observada en las biopelículas vivas. La diferencia en la fotoconductividad entre las biopelículas y los nanocables purificados probablemente se deba a los materiales no conductores, como las células y los polisacáridos presentes en las biopelículas.

Para cuantificar la fotorrespuesta de nanocables individuales, utilizamos microscopía de fuerza atómica fotoconductora (pc-AFM)41 (λ = 405 nm, potencia láser inicial = 3,20 kW/cm2, Fig. 2f). Los nanocables individuales mostraron un aumento de hasta 100 veces en la conductancia tras la fotoexcitación (Fig. 2h-i, Tabla complementaria 2). Es probable que las diferencias en la fotoconductancia se deban a la variación en la potencia del láser causada por la configuración experimental (consulte los métodos y la Fig. 11 complementaria para obtener más detalles). La diferencia en la fotoconductividad entre los nanocables individuales y la red de nanocables probablemente se deba a la resistencia de contacto entre nanocables y nanocables-electrodo. En particular, el aumento de 10 a 100 veces observado en la conductancia de los nanocables de proteína con una polarización relativamente baja (< 0,5 V) es sustancialmente mayor que el de las porfirinas sintéticas42 que muestran solo un aumento de hasta 5 veces con una polarización muy alta de 12 V.

Estos experimentos en nanocables individuales confirman que la respuesta de fotoconductividad observada en redes de nanocables se debe únicamente a los nanocables y no a un artefacto de la configuración de medición. Además, la fotoconductividad observada no se debe a los efectos de calentamiento porque todos los experimentos de pc-AFM se realizaron en un entorno de temperatura controlada, inhibiendo así cualquier aumento sustancial de la temperatura. Además, la linealidad y la estabilidad de nuestras curvas IV indican que el aumento de conductividad medido no se debe al calentamiento (Fig. 2g). Además, la conductividad de los nanocables OmcS disminuye con el calentamiento43, mientras que observamos un aumento de hasta 100 veces en la conductividad con la fotoexcitación.

Para comprender el mecanismo de la fotoconductividad en los nanocables de proteínas, realizamos una espectroscopia de absorción transitoria de femtosegundos (fs-TA) determinando la dinámica de los electrones tras la fotoexcitación en una escala de tiempo ultrarrápida (~100 fs)5,44 (Fig. 3a). El fs-TA realiza un seguimiento de los cambios espectrales UV-Vis cambiando el tiempo de retardo Δτ entre la bomba láser de femtosegundos y los pulsos de la sonda y registrando un espectro de absorbancia diferencial (ΔA) en cada tiempo de retardo44 (Fig. 3a). Este espectro diferencial contiene información sobre los procesos dinámicos que ocurren en el sistema, como la migración de energía en estado excitado, los procesos de transferencia de electrones o protones y la isomerización44. En contraste con los estudios anteriores de fotoexcitación en la banda de Soret (Figs. 1, 2), realizamos fs-TA usando excitación en la banda Q (λ = 545 nm) para evitar daño térmico y monitorear cambios en la región. de las bandas de absorción más fuertes44. Es importante tener en cuenta que las transiciones de banda Q y Soret surgen del mismo estado fundamental, lo que hace que la excitación de banda Q sea un proxy adecuado para monitorear estos procesos44. La fotoexcitación con λ = 530, 545 y 400 nm produjo una dinámica similar, demostrando un amplio rango espectral para la fotoconductividad (Figs. 4, 5 complementarias). Ni el tampón solo ni el sustrato en blanco mostraron ninguna respuesta, las mediciones en estado sólido y líquido son similares, y la dinámica de ET fue independiente de la intensidad y potencia del láser (Figuras complementarias 6, 7, 8), lo que indica que la dinámica observada se debe a los nanocables y no un artefacto del medio ambiente o del sustrato.

un esquema de fs-TA. Un haz de bomba (λ = 545 nm) excita una muestra de nanocables y es seguido por un haz de sonda después de un tiempo de retraso. La absorción diferencial entre los espectros inicial y retardado en el tiempo se detecta y se notifica como densidad óptica. b Datos promediados de absorción transitoria de nanocables (n = 6 experimentos independientes) donde los colores representan la densidad milióptica (mOD). c Cambio normalizado en la absorción diferencial con longitud de onda en diferentes tiempos de retardo. Las longitudes de onda clave están marcadas como λ = 410 nm (verde), λ = 424 nm (rojo) y λ = 367 nm (azul). d Los espectros experimentales (sólidos) y simulados (discontinuos) de nanocables oxidados, reducidos y doblemente oxidados. Los marcadores de longitud de onda son los mismos que en la Fig. 3c. e Cambio normalizado en la absorción diferencial durante el tiempo de retardo en longitudes de onda clave. Los marcadores de tiempo se muestran en el mismo color que las trazas de tiempo en la Fig. 3c. Las trazas en c y e representan la media de n = 6 experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Tras la fotoexcitación de los nanocables de proteínas, los electrones pasan del estado fundamental al estado excitado, lo que reduce la población del estado fundamental. Esta disminución provocó una señal negativa en ΔA a 410 nm conocida como blanqueador en estado fundamental44 (Fig. 3b, c). Además, observamos un ΔA positivo que es indicativo de absorción en estado excitado a λ = 367 nm y λ = 424 nm después de Δτ = 0,1 ps y 2 ps, respectivamente (Fig. 3c, d). Estas absorciones están ausentes en los nanocables nativos, oxidados por aire y no excitados (Fig. 3d), lo que indica que la fotoexcitación está causando estas absorciones. En particular, la absorción a λ = 424 nm concuerda bien con la absorción de nanocables reducidos químicamente (Fig. 3d), lo que sugiere que tras la fotoexcitación, la transferencia de electrones en estado excitado reduce los hemo en los nanocables y, por lo tanto, la fotorreducción contribuye a la fotoconductividad de los nanocables.

Para comprender el origen de los diferentes estados de oxidación transitorios, determinamos la cinética en las longitudes de onda clave mencionadas anteriormente utilizando un modelo secuencial44 que arrojó la primera escala de tiempo de excitación de 19 ± 23 fs (ver métodos). Esta escala de tiempo es más rápida que la función de respuesta del instrumento (100 ± 50 fs) y, por lo tanto, puede tratarse como una excitación instantánea en la escala de tiempo de la medición (Fig. 4a). Luego de esta excitación, las cargas se transfirieron entre hemos con un tiempo de decaimiento de 212 ± 27 fs. Los espectros correspondientes son una superposición de un blanqueador en estado fundamental y la aparición de una nueva característica alrededor de 367 nm, que se puede atribuir a los hemos doblemente oxidados según las simulaciones espectrales (Fig. 3d). Según las simulaciones (ver a continuación, Fig. 4d), concluimos que la transferencia de carga ultrarrápida también da como resultado la formación de un hemo reducido en su estado excitado, que es espectroscópicamente oscuro. También encontramos un segundo decaimiento con una constante de tiempo de 1,0 ± 0,1 ps que puede atribuirse a la relajación del hemo reducido excitado que aumenta en absorción en el Soret reducido a λ = 424 nm. Además, encontramos un tercer tiempo de decaimiento de 7,9 ± 0,3 ps que se puede atribuir a la recombinación a su estado inicial, incluidas las transferencias de carga a los estados fundamentales del hemo oxidado individualmente.

un diagrama de nivel de energía simplificado para hemos que representa los cambios que ocurren con la fotoexcitación en la absorción transitoria y sus respectivos tiempos de decaimiento. b La corriente oscura en el estado fundamental surge debido a la propagación de un estado reducido creado por la inyección de electrones desde el electrodo. c La fotocorriente se debe a la excitación del láser que inicia una transferencia de carga ultrarrápida entre los hemos, creando hemos recién reducidos (rojo) y doblemente oxidados (azul). La fotorreducción proporciona portadores de carga adicionales y una mayor fuerza impulsora para la transferencia de carga, lo que por lo tanto aumenta la corriente bajo polarización. d Simulaciones de dinámica cuántica de transferencia de carga ultrarrápida entre hemos en nanocables de proteínas, formando un hemo doblemente oxidado y un estado excitado de un hemo reducido.

Además, comparamos nuestros espectros UV-Vis experimentales de nanocables con los cálculos de la teoría funcional de densidad dependiente del tiempo de hemos en el nanocable (Fig. 3d). El máximo de la banda de Soret calculada en el hemo reducido (λ = 420 nm) se desplaza 9,5 nm hacia el rojo del máximo de la banda para el hemo oxidado, de acuerdo con el cambio de 10,5 nm observado experimentalmente (Fig. 3d). Estos análisis computacionales sugieren además que la fotoexcitación provoca la reducción de hemos en los nanocables. Nuestro hallazgo es consistente con estudios previos de fotorreducción de citocromos monoméricos mediados por el estado excitado de los hemos inducido por la luz, incluso en ausencia de donantes de electrones externos45,46.

Para evaluar los datos de cinética transitoria obtenidos utilizando el modelo secuencial ajustado a datos experimentales, realizamos simulaciones de dinámica cuántica en el nivel de teoría Extended Hückel47,48. Simulamos la propagación de un paquete de ondas de electrones en estado excitado a partir de hemos en los nanocables, en una orientación de apilamiento deslizante y de apilamiento en T7. Nuestras simulaciones sugieren una escala de tiempo de ~ 100 fs para la transferencia de carga fotoinducida entre el par de hemos apilados por deslizamiento (Fig. 4d). Esta escala de tiempo concuerda con la escala de tiempo determinada experimentalmente para la transferencia de carga del estado excitado (212 ± 27 fs). La probabilidad de supervivencia para la transferencia de electrones en un par de hemo de pila deslizada sigue siendo baja (<60%) para la mayoría de los niveles de energía, lo que indica una alta probabilidad de transferencia de electrones a un hemo cercano dentro de 100 fs (Fig. 9 complementaria). Por lo tanto, la escala de tiempo para la transferencia de electrones entre pares de hemo de apilamiento deslizado sigue siendo similar para la mayoría de los niveles de energía.

Como no se agregó ningún donante de electrones externo, nuestros resultados sugieren que los electrones adicionales que reducen el hemo son intrínsecos al propio nanocable. Analizamos más a fondo la posibilidad de que la proteína circundante provoque la fotorreducción observada de los hemos OmcS. Varios aminoácidos aromáticos, incluidos el triptófano y la tirosina, se encuentran dentro de los 5 Å de los hemos en el OmcS. Aunque la excitación de triptófano o tirosina no es posible en las longitudes de onda utilizadas en este estudio45,46, consideramos la posibilidad de que la transferencia de electrones pueda extinguir un hemo fotoexcitado de manera similar a las flavinas en un criptocromo49. Esta extinción reduciría un grupo hemo y dejaría un radical de aminoácido. El aminoácido candidato más probable para la formación de radicales es el triptófano porque sus radicales tienen una absorbancia que explicaría las especies de 367 nm50. Si bien es posible la formación de tales radicales, la intensidad de la señal en las mediciones de fs-TA está determinada por los coeficientes de extinción molares (ε) de las especies (transitorias). El coeficiente de extinción molar de la banda de Soret para OmcS es aproximadamente 100 veces mayor que el de los radicales triptófano50,51. El blanqueador en estado fundamental representa todos los hemos fotoexcitados en los nanocables OmcS y las especies correspondientes a λ = 367 nm y 424 nm tienen absorciones diferenciales de ~ 20 y 10% de la magnitud total, respectivamente (Fig. 3e). Por lo tanto, el número de radicales de triptófano creados a partir de la transferencia de electrones debe ser mayor que el número de hemos excitados en OmcS si la especie radical en λ = 367 nm surge del triptófano. Tal posibilidad parece improbable porque solo se puede crear un radical para cada hemo excitado extinguido. Por lo tanto, los espectros observados no pueden explicarse por los radicales de aminoácidos.

También evaluamos las posibilidades de que otras fuentes de electrones causen fotorreducción. Descubrimos que los procesos de fotones múltiples están ausentes en nuestros experimentos porque la dinámica ET era independiente de la intensidad y la potencia del láser (Fig. 8 complementaria). La magnitud de la fotocorriente también es lineal con mayor potencia (Fig. 3 complementaria).

Las impurezas redox tampoco contribuyeron a los espectros medidos debido a la dinámica idéntica en solución y en estado sólido (Fig. 7 complementaria). La fotodegradación tampoco cambió la dinámica de transferencia de electrones, solo la magnitud de los espectros en <10% durante dos horas.

Por lo tanto, consideramos una posibilidad alternativa de que los hemos apilados en paralelo puedan servir como un par donante y aceptor de electrones (Fig. 4). Presumimos que la transferencia de carga del estado excitado se produce entre dos hemos vecinos con solo uno de los hemos en estado excitado. Tal transferencia de carga daría como resultado la aparición de un hemo reducido y dejaría un hemo doblemente oxidado (Fig. 4). El espectro UV-Vis calculado de un grupo hemo doblemente oxidado mostró un máximo de absorción en λ = 365 nm que concuerda con las especies observadas experimentalmente en λ = 367 nm. Nuestro espectro computado de un hemo doblemente oxidado recupera el cambio azul observado en el experimento de absorción transitoria (Fig. 10 complementaria). La concordancia cualitativa entre los espectros calculados y experimentales es independiente del estado de espín de las especies doblemente oxidadas, como el estado singlete y triplete.

Para identificar la naturaleza de las especies doblemente oxidadas, realizamos un análisis de las poblaciones de espín atómico. Encontramos que el cambio en las poblaciones de espín ocurre solo en los ligandos y no en el centro de hierro. Por lo tanto, nuestro análisis sugiere que las especies doblemente oxidadas son el radical Fe3+ + porfirina, lo que concuerda con los espectros observados a 367 nm. Estos análisis sugieren además que las especies doblemente oxidadas no son Fe4+ debido a la falta de cambio en la densidad de espín en el centro del hierro tras la oxidación adicional del hemo en el estado Fe3+ (Figura 10 complementaria y Tabla complementaria 1).

Para evaluar aún más la viabilidad termodinámica de las especies de hemo radicales, utilizamos el ciclo de Rehm-Weller. Este análisis requiere cuatro términos energéticos: (1) energía requerida para formar especies de hemo radicales (basado en sistemas de hierro-porfirina52) (1,7 V), (2) el potencial redox del estado fundamental de OmcS (−212 mV)51, (3) la energía del fotón utilizada para excitar los nanocables OmcS (λ = 545 nm = 2,3 eV), y (4) la diferencia de energía vibratoria entre los estados fundamental y excitado, denominada energía de estabilización de Coulomb asociada con el par de iones radicales intermedios53 (ωp) ~60 yo V. Por tanto, la energética de este proceso sería ΔGet = [1,7 eV–(−0,212 eV) + 0,06 eV]−2,3 eV = −0,4 eV. Por lo tanto, ΔGet < 0 para la formación de especies de hemo radicales, haciéndolas energéticamente viables. Nuestro análisis es una estimación más baja de la energía neta disponible para la formación de las especies radicales. Por lo tanto, en combinación con nuestro análisis simulado, nuestros estudios sugieren que las especies doblemente oxidadas son el radical Fe3+ + porfirina y los nanocables se fotorreducen mediante la transferencia ultrarrápida de carga de hemo a hemo inducida por luz.

Con base en los resultados anteriores, proponemos el siguiente modelo para el origen de la fotoconductividad en los nanocables OmcS (Fig. 4). Este modelo se centra en los estados singlete y no en los estados triplete porque estos estados son espectroscópicamente oscuros y serían menos pronunciados debido a sus energías más bajas. Como estos nanocables transportan cargas a través de un apilamiento continuo de hemos (Fig. 1c), nuestros experimentos anteriores han demostrado que pueden tratarse como conductores redox, con la transferencia de carga de largo alcance gobernada por un mecanismo de salto predicho teóricamente con una pérdida de portador insignificante sobre micrómetros54. Todos los hemo en los nanocables se oxidan inicialmente y se encuentran en su estado fundamental, según lo confirma la espectroscopia UV-Vis (Fig. 2b). Al aplicar una polarización, se inyectan electrones desde el electrodo al nanocable, creando un estado reducido que viaja a través del nanocable (Fig. 4b). La fotoexcitación desencadena una transferencia de carga ultrarrápida que da como resultado un estado reducido adicional que persiste durante una escala de tiempo de picosegundos, sin ninguna polarización aplicada, lejos del electrodo (Fig. 4c). Este estado reducido recién formado tendrá una movilidad similar al estado de inyección de electrodos, ya que ambos están presentes en el mismo nanocable con estructura idéntica. Por lo tanto, tras la fotoexcitación, la densidad de los estados reducidos aumenta, lo que aumenta la densidad de portadores del OmcS para generar fotoconductividad en los nanocables. La fotorreducción observada en nuestro fs-TA es consistente con este modelo.

Además de la mayor densidad de portadores debido a los electrones fotogenerados, es probable que la movilidad de los electrones aumente con la fotoexcitación debido al aumento de la fuerza impulsora para la transferencia de carga en el estado excitado de los hemo43. Tras la fotoexcitación, un electrón pasa del estado fundamental al estado excitado. La transferencia de carga ultrarrápida entre los hemos vecinos crea un hemo de estado reducido en el estado excitado y un hemo doblemente oxidado (Fig. 4c, d). El hemo en estado reducido puede entonces relajarse desde el estado excitado al fundamental. Tras la fotoexcitación, el nanocable oxidado uniformemente se reduce parcialmente y se oxida parcialmente dos veces (Fig. 4c).

El hemo doblemente oxidado generado alterará las energías redox de la cadena de hemo, con un potencial redox más positivo. Anteriormente hemos encontrado que el potencial redox de los hemo OmcS se vuelve sustancialmente positivo tras la oxidación43. Los nanocables OmcS transportan cargas a través de un mecanismo de salto54, un proceso en el que una carga (electrón o hueco) reside temporalmente en un hemo, cambiando su estado redox. La fuerza impulsora para la transferencia de carga depende de las energías redox de los hemos que donan y aceptan electrones. Por lo tanto, la tasa de transferencia de carga está directamente relacionada con la movilidad.

Para el estado totalmente oxidado (no excitado), este proceso se inicia en la superficie del electrodo donde los electrones inyectados saltan a los sitios redox de los nanocables, creando hemos reducidos localmente. Para el estado fotoexcitado, este proceso se mejora porque la transferencia de un electrón a la especie doblemente oxidada y la eliminación de un electrón de un hemo reducido son significativamente más favorables en el nanocable iluminado que para el nanocable oxidado en la oscuridad. La mayor probabilidad de transferencia de carga tras la fotoexcitación dará como resultado una mayor movilidad. Además, la transferencia de carga ultrarrápida inicial entre hemos aumenta la vida útil del estado fotogenerado. Tanto la generación de una "nueva" carga móvil como el aumento de su movilidad contribuirán al aumento observado en la conductividad tras la fotoexcitación.

En resumen, demostramos, por primera vez, una fotoconductividad significativa en un sistema vivo debido a la transferencia de carga ultrarrápida inducida por la luz dentro de los nanocables de proteínas. El sorprendente origen de la fotoconductividad en estos sistemas naturales radica en la mayor densidad de portadores y movilidad tras la fotoexcitación.

Aunque la transferencia de electrones ultrarrápida puede ocurrir en citocromos monoméricos, generalmente requiere colorantes incorporados como fotosensibilizadores y donantes de electrones de sacrificio36 que pueden ser tóxicos para las células1. Por el contrario, encontramos que los nanocables de proteína exhiben intrínsecamente una transferencia de carga robusta y ultrarrápida sin necesidad de dicho etiquetado selectivo de sitio. Nuestros estudios establecen así que los nanocables OmcS son fotoconductores intrínsecos a las células con capacidad de transferencia de electrones ultrarrápida, eliminando así la necesidad de materiales extraños como colorantes moleculares o nanopartículas inorgánicas que limitan el rendimiento catalítico1.

Además, nuestros estudios muestran que la transferencia de carga sub-ps es posible en proteínas naturales en un estado excitado. Estudios previos de transferencia de electrones ultrarrápidos han informado tasas de estado fundamental de 15 a 90 ps en los hemos apilados más cercanos36. Es probable que esta diferencia se deba a que se sabe que las velocidades del estado excitado son más rápidas debido a la mayor energía y la mayor deslocalización orbital en comparación con las velocidades del estado fundamental49.

Aunque muchos estudios de EET bacterianos siguen centrados en los electrones, los protones juegan un papel muy importante, no solo en la generación de energía bacteriana, sino también en la conductividad electrónica de las proteínas55. Por ejemplo, a través de mediciones de la tasa de transferencia de electrones intrínseca, encontramos previamente que tanto la energía de una glutamina (aceptor de protones) como su proximidad a una tirosina vecina (donante de protones), regulan el transporte de huecos sobre micrómetros en amiloides a través de un balanceo de protones. mecanismo56. Por lo tanto, es muy importante acoplar la transferencia de electrones/protones para acelerar la EET y para el desarrollo de biomateriales basados ​​en proteínas conductoras electrónicamente.

La gran área de superficie de estos nanocables, combinada con su biocompatibilidad y falta de toxicidad, los convierte en candidatos atractivos para un campo emergente de bioelectrocatálisis de células completas impulsada por luz para una amplia gama de aplicaciones, como la división del agua, la detección química y la fijación de CO2 y producción de productos químicos, combustibles y materiales57. Nuestros estudios también pueden ayudar a establecer la producción eficiente y estable de combustibles líquidos a partir de la luz solar utilizando un enfoque de luz solar líquida5. Los estudios futuros sobre nanocables con diferente apilamiento de hemo y entorno proteico8 o la sustitución de los metales de hierro por zinc58 o estaño59 podrían variar las interacciones entre los cofactores de hemo para alterar las propiedades electrónicas y fotofísicas de los nanocables para una funcionalidad sintonizable57.

La cepa CL-1 de Geobacter sulfurreducens60, que produce una abundancia elevada de proteína OmcS37, se obtuvo de nuestra colección de cultivos de laboratorio y se cultivó en electrodos en un sistema bioelectroquímico como se describió anteriormente20,61. Para el crecimiento en cultivo líquido, las células se cultivaron hasta la fase estacionaria61 y se recolectaron mediante centrifugación, y luego se usó una versión ligeramente modificada de un protocolo7 descrito anteriormente para cortar los filamentos extracelulares de las células. En resumen, las células sedimentadas se suspendieron en etanolamina 150 mM pH 10,5 y se mezclaron durante 2 min a baja velocidad en una unidad comercial (Waring). Las células y los desechos celulares se eliminaron por centrifugación, primero a 13 000 y luego a 23 000 x g. Luego, los filamentos de OmcS se recolectaron por precipitación en sulfato de amonio al 12,5 % o por ultracentrifugación a 100 000 xg, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente para obtener nanocables microbianos de G. sulfurreducens10. Las muestras de filamentos OmcS recogidas se resuspendieron y almacenaron en etanolamina 150 mM, pH 10,5, y se dializaron para eliminar el sulfato de amonio residual cuando fuera apropiado.

Los espectros UV-Vis se registraron con un espectrofotómetro (Avantes AvaSpec-ULS2048CL-EVO). Para los nanocables, se limpió un portaobjetos de cuarzo con etanol y se dejaron caer 2 µl de proteína 80 µM sobre este portaobjetos y luego se secó durante 20 min en el desecador. Se dejaron caer otros 2 µl en el mismo lugar y se secó de nuevo en el desecador durante 20 min. El espectro se recogió para la muestra oxidada con aire. Luego se dejaron caer 40 mg/ml de ditionito de sodio en agua para cubrir la mancha de proteína (2–3 µl). El ditionito provocó una reducción química de los hemos en la proteína. Luego se registró el espectro del material reducido. Todos los espectros se normalizaron de manera que los valores de absorbancia mínimo y máximo para longitudes de onda superiores a 380 nm se establecieron en cero y 1, respectivamente. Las mediciones de estado sólido del biofilm se tomaron en un electrodo FTO en condiciones de hidratación con el fondo de un electrodo FTO limpio sustraído.

Se utilizaron tres tipos diferentes de electrodos, a base de oro (Au), tungsteno (W) y óxido de estaño dopado con flúor (FTO). Los diseños consistían en electrodos interdigitados, que crean un patrón de "dedo" en el que cada línea impar está conectada a una almohadilla y cada par está conectada al contacto eléctrico opuesto. Este empaquetamiento de electrodos denso asegura una gran cantidad de contactos electrónicos. Los datos medidos tienen un promedio de más de 132 pares de conexiones de cables y proporcionan una señal superior en comparación con un dispositivo de un solo electrodo.

Para los electrodos de oro, el espacio entre cada línea era de 5 µm, y para los electrodos de tungsteno y FTO, el espacio era de 10 µm. Para todos los casos, el electrodo (la parte metalizada) tenía 10 µm de ancho.

Los electrodos de oro y tungsteno se fabricaron mediante litografía UV en una oblea de silicio oxidada térmicamente. La oxidación térmica creó una capa de óxido de silicio de 300 nm que proporciona un sustrato simple y eléctricamente aislante. Los electrodos metálicos se fabricaron recubriendo por rotación una resistencia doble, que constaba de LOR 5-A y S1805. LOR 5-A se revistió a 3000 rpm durante 1 min seguido de 5 min de calentamiento a 180 °C. Después de este paso de horneado, se aplicó una segunda capa protectora S1805 a 3000 rpm durante 1 min y se curó a 120 °C durante 2 min. Posteriormente, las resistencias fueron expuestas a la radiación UV a través de una máscara de sombra y reveladas en revelador MIF 319 durante 2 minutos. Luego, los fotoprotectores estructurados se metalizaron con Ti o Cr de 5 nm y Au o W de 40 a 60 nm. Un despegue en NMP calentado (80 a 120 °C) eliminó los resistentes metalizados y dio como resultado el electrodo de microestructura final. A continuación, se revistió por rotación el dispositivo con un revestimiento de protección. Este recubrimiento se lavó con acetona antes de usar el electrodo. Cada electrodo se probó antes de la deposición de proteínas para garantizar un aislamiento eléctrico adecuado entre los dos electrodos.

Para los electrodos FTO IDE, se utilizó FTO comercialmente disponible en vidrio de cuarzo. El protector S1805 se revistió por rotación y se estructuró como se describió anteriormente. Después de la estructuración, este protector se usó como una máscara suave en el grabado con iones reactivos. El grabado se llevó a cabo en un Oxford Plasmalab 100 RIE con una presión de cámara de 8 mTorr y un flujo de gas de 8 sccm Cl2 y 40 sccm Ar. El grabado se llevó a cabo hasta que se eliminó por completo el FTO no deseado. El fotoprotector restante se limpió en NMP caliente (120 °C) y los dispositivos finales se cubrieron con una capa protectora. Este revestimiento se eliminó con acetona antes del uso de los electrodos. Cada electrodo se revisó cuidadosamente para garantizar que los dos contactos estuvieran aislados eléctricamente.

Las mediciones de conductividad en nanocables y biopelículas se realizaron como se describió anteriormente62. Las conexiones a los electrodos del dispositivo se realizaron con una estación de sonda (MPI TS50) dentro de una caja oscura que formaba una jaula de Faraday y también bloqueaba la luz de fondo. La corriente y el voltaje se aplicaron utilizando un analizador de parámetros de semiconductores con preamplificadores (Keithley 4200 A-SCS) que permiten una resolución de corriente de 1 fA y voltaje de 0,5 μV. Las mediciones de conductancia de CC de dos puntos utilizaron dos agujas de sonda para hacer contacto con el dispositivo en dos electrodos adyacentes. Se aplicó un voltaje fijo en el rango de ±0,3 V a los dos electrodos durante un mínimo de 100 s en modo de muestreo hasta que se alcanzó una corriente constante. Los puntos de tensión-corriente se ajustaron con una línea y se utilizó la pendiente para determinar la conductancia (G).

Los dispositivos se prepararon dejando caer 0,5 µl de nanocables de 8 µM en etanolamina 150 mM, pH 10,5, sobre el dispositivo y se dejaron secar en una atmósfera ambiente durante la noche. La gota formada sobre el material tenía un diámetro de 1,4 ± 0,1 mm. El área del electrodo fue de 2 × 2 mm, lo que aseguró que todo el material estuviera en contacto eléctrico.

Para realizar las mediciones de fotoconductividad, la estación de prueba descrita anteriormente se equipó con un láser de diodo, con un flujo de salida promedio de 100 mW/cm2 y una longitud de onda central de 408 nm. Este punto láser se ajustó para que fuera más grande que el área del electrodo, lo que aseguraba una excitación homogénea del material. El rayo láser fue bloqueado/liberado utilizando un obturador óptico con un tiempo de respuesta de 1 ms.

Las mediciones de conductancia en nanocables reducidos se realizaron mezclando 0,25 µl de una solución concentrada de ditionito de sodio con 9,75 µl de nanocables en un entorno anaeróbico de modo que hubiera un exceso molar de 50 veces de ditionito respecto a la concentración de hemo en la solución final. Se dejaron caer 0,5 µl sobre un electrodo y se secaron en la cámara anaeróbica durante la noche.

Los espectros de absorción transitoria se recolectaron en el Centro de Nanomateriales Funcionales (CFN), parte del Laboratorio Nacional de Brookhaven. Se recopilaron más datos en la Universidad de Drexel. La relación señal/ruido del espectrómetro CFN comercial fue superior a los datos de Drexel, por lo tanto, los datos recopilados en Drexel se usaron únicamente en el suplemento de este manuscrito. La descripción detallada se refiere a la recopilación de datos en CFN.

Los espectros de TA se recogieron usando un espectrómetro de TA Helios (Ultrafast Systems). La longitud de onda de excitación se generó en un TOPAS OPA. El pulso de la sonda se generó a través de un supercontinuo en fluoruro de calcio.

Para cada medición, la superposición espacial se optimizó para la señal más fuerte. Cada conjunto de datos se iteró durante varias horas. Luego, cada iteración se comparó con la media de la iteración para garantizar la estabilidad a largo plazo del espectrómetro y el material de muestra.

La muestra se preparó arrojando por goteo 5 µl de solución de proteína sobre un sustrato de cuarzo recién limpiado. Las muestras se dejaron secar durante 60 minutos en un desecador. Esta deposición se repitió para crear películas más gruesas. Basándose en la transmisión óptica, se eligió una ubicación en la muestra con suficiente absorción de banda Soret y dispersión aceptable.

Los espectros de TA recopilados se procesaron utilizando tres softwares: Surface Xplorer (Ultrafast Systems), MATLAB y Glotaran. Se utilizó Surface Xplorer para visualizar los datos y seleccionar mediciones con señal adecuada al ruido. Esta selección redujo el número de espectros procesados ​​a 15. De estas mediciones, siete se bombearon a 545 nm (que se muestran en el texto principal), cuatro a 530 nm (que se muestran en SI) y cuatro a 400 nm (que se muestran en SI). Todas estas medidas fueron evaluadas para determinar la cinética y dinámica de la evolución espectral. La evaluación principal se realizó para una longitud de onda de bomba de 545 nm, ya que depositaba la energía más baja y, por lo tanto, calentaba el material de muestra. Las otras dos longitudes de onda confirmaron la cinética determinada.

Se usó Surface Xplorer para compensar el chirrido espectral asociado con la dispersión dependiente de la longitud de onda en la muestra usada y el sustrato de cuarzo. Esta corrección aseguró que el punto cero del tiempo fuera independiente de la longitud de onda. Después de este procesamiento inicial, los 1024 puntos de longitud de onda medidos se promediaron de forma adyacente a 512 puntos, lo que resultó en una resolución de longitud de onda de aproximadamente 1 nm.

Los datos preprocesados ​​luego se importaron a MATLAB. Se promediaron seis mediciones a una bomba de 545 nm en un solo conjunto (después de tener en cuenta la fluctuación de tiempo cero). Estos conjuntos de datos se muestran en el texto principal. La dinámica a 410 nm, 367 nm y 424 nm se ajustó simultáneamente con una doble función exponencial convolucionada con la función de respuesta del instrumento y un modelo de inyección instantánea como función de Heaviside. Los tiempos de vida de este ajuste dinámico simple de tres longitudes de onda se utilizan como puntos de partida para el análisis detallado del objetivo utilizando Glotaran.

Los datos preprocesados ​​(del procesamiento de datos de Surface Xplorer) luego se cargaron en Glotaran y se truncaron a −2 ps hasta el infinito en el tiempo y 340-505 nm en el espacio de longitud de onda. Este software se utilizó para el análisis global. El modelo asume una dinámica de decaimiento global definida por un número fijo de constantes de decaimiento. Basándonos en nuestro modelo, decidimos que un análisis secuencial es el más adecuado para describir los procesos en OmcS fotoexcitado.

El modelo secuencial, sin embargo, no puede separar directamente las especies individuales del blanqueador en estado fundamental de las especies principales. Esto es causado por la superposición temporal entre las desintegraciones y la desintegración paralela al estado fundamental de las especies de hemo excitadas que no experimentan completamente un paso de separación de carga.

El modelo secuencial supone una excitación, que se ajusta a 19 ± 23 fs. Esto es más rápido que la función de respuesta del instrumento de 100 ± 10 fs. Por lo tanto, la excitación puede considerarse instantánea (lo que justifica la aproximación de Heaviside utilizada en el análisis preliminar en MATLAB). Después de la excitación, las cargas se transfieren de un hemo a otro en 212 ± 27 fs. Los espectros correspondientes son una superposición de un blanqueador en estado fundamental y la aparición de una nueva característica alrededor de 367 nm, que se identifica como un hemo doblemente oxidado (según la simulación espectral presentada). Esta transferencia de carga da como resultado la formación de un hemo reducido en el estado excitado. Un segundo decaimiento con una constante de tiempo de 1 ± 0,1 ps describe la relajación del hemo reducido excitado. Una tercera constante de tiempo final con 7,9 ± 0,3 ps describe la relajación del sistema a su estado inicial, incluida la transferencia de carga al estado fundamental del hemo oxidado único.

La topografía y la conductividad eléctrica de los nanocables en la superficie de oro se midieron utilizando los modos de medición de microscopía de fuerza atómica conductora (c-AFM, ORCA™) y tapping convencional (AC) con un AFM comercialmente disponible (Cypher ES, Oxford Instruments Asylum Research, EE. UU.) equipado con excitación fototérmica blueDrive™. La sonda era una sonda ASYELEC-01-R2 disponible comercialmente (Asylum Research) con revestimiento de Ti/Ir y frecuencia de resonancia nominal f = 75 kHz, constante de resorte k = 2,8 N/m y radio de punta Rtip = 28 ± 10 nm; los valores medidos fueron f0 = 86,6 kHz y k0 = 5,8 N/m para la sonda específica utilizada en estas mediciones. Para sesgar la muestra, se adhirió un pequeño imán de neodimio (1/32" x 1/16" de diámetro, K&J Magnetics) y se puso en contacto eléctricamente con la superficie superior de la muestra de nanocables sobre oro usando pintura plateada (PELCO ® Leitsilber, Ted Pella).

Para la topografía en modo tapping, la sonda se impulsó con activación piezoeléctrica a una velocidad de exploración de 1 línea/s, una amplitud libre de 120 nm (0,58 V a una sensibilidad de 207 nm/V) y un punto de referencia de ~100 nm (0,5 V ) para mantener la interacción punta-muestra muy suave en el llamado estado "atractivo" o "sin contacto" para evitar dañar los nanocables.

Después del escaneo topográfico, se usó cAFM con un punto de ajuste de fuerza de 50 nN para ejecutar mediciones del punto IV en nanocables individuales para medir su conductividad (n = 15 nanocables), con un barrido de voltaje de muestra de ±0,5 V a una velocidad de barrido de 1 V/s durante 20 ciclos de barrido a una tasa de adquisición de 2 kHz (filtro de paso bajo de 1 kHz). Los efectos adicionales de la fotoexcitación en la conductividad de los nanocables se examinaron alternando el láser blueDrive™ como fuente de excitación (405 nm, 10 mW CC, con un diámetro de punto de 2 ± 1 µm) en al menos 20 barridos IV secuenciales. Esto se logró utilizando el cubo de filtro 0.01X proporcionado (Asylum Research) y colocando el punto láser en el vértice de la punta de la sonda (en lugar de usarlo como excitación oscilatoria de la sonda); esto proporciona [10e-3 W]/[π*(1e-6 m)2]*0,01 = 32 µW/µm2 de iluminación en los nanocables.

Para los experimentos de control en estas mediciones de pc-AFM, también se preparó una muestra de oro pelado de plantilla nueva (idéntica a la superficie en la que se depositaron los nanocables) con un contacto eléctrico como el anterior. Como control positivo, se midió la conductividad de la punta de oro en las mismas condiciones (fuerza de carga de 50 nN, ±0,5 V a 1 V/s, 20 ciclos) para garantizar un contacto óhmico en ausencia de nanocables. Como control negativo para las mediciones fotoconductoras, la conductividad de la punta de oro se midió en las mismas condiciones (fuerza de carga de 50 nN, ±0,5 V a 1 V/s, 20 ciclos) con la excitación blueDrive activada y desactivada secuencialmente para confirmar que no había no hubo cambios en la conductividad de la punta de oro de la excitación de 405 nm en ausencia de nanocables.

En cada punto de recolección de un nanocable individual, se recolectaron al menos 20 curvas IV. La última mitad de todas las curvas de voltaje de corriente recopiladas (mínimo 10 curvas) en un solo punto se utilizó para calcular la conductancia. Luego, las curvas IV se ordenaron mediante nanocables y se midió la pendiente de cada curva para obtener la conductancia. Para todos los nanocables, cualquier valor atípico en la conductancia se eliminó mediante tres análisis de desviación de absolución mediana en el log10 de conductancia. Todos los valores de conductancia individuales restantes para cada nanocable se promediaron para obtener la conductancia media del nanocable único. El análisis de las curvas de tensión de corriente del láser APAGADO y del láser ENCENDIDO fue idéntico.

Al interpretar los experimentos de fotoexcitación, es crucial verificar si el experimento se realizó en un régimen de excitación lineal o no lineal. En el último, la fotoexcitación sería lo suficientemente fuerte como para desencadenar efectos no lineales (es decir, absorción saturable) o provocar una interacción electrón-electrón (dispersión ee, efecto Auger, etc.). Estos efectos harían más desafiante una discusión concluyente de los experimentos. En el régimen lineal, solo se excita un pequeño porcentaje de moléculas, mientras que la mayoría permanece en su estado fundamental. Si bien no existe un umbral máximo para el régimen lineal frente al no lineal, es común aceptar menos del 1% de excitación como lineal.

Calculamos el porcentaje de excitaciones en función de la densidad de potencia óptica conocida de 100 mW/cm2 y la vida útil total del sistema fotoexcitado (τ = 7,9 ps). El concepto central que se utiliza aquí es que, en un momento dado, una cierta cantidad de fotones golpean los hemos y los excitan, mientras que los hemos previamente excitados se recombinan en su estado fundamental.

La recombinación se describe como N(t) = N(t-Δt) e^-Δt/τ, con Δt como paso de tiempo pequeño63. La excitación del láser CW se discretizó utilizando el paso de tiempo para producir un flujo de fotones total establecido por la potencia del láser. Suponiendo un rendimiento cuántico del 100%, esto significa que la generación de hemos excitados se describe directamente por el flujo de fotones. A partir de t = 0, la población aumenta en competencia con la recombinación como N(t) = G(Δt) -N(t-Δt) e^-Δt/τ. Después de un tiempo de un nanosegundo, N(t) se aproxima a un valor de estado cuasi-estacionario de 1,6 x 106 moléculas/cm2. Comparando este valor con la densidad de proteína total de 2,5 x 1013 moléculas/cm2 se obtiene una proporción de 6,4 x 10−6 %. Este valor aproximado está muy por debajo del 1%, lo que justifica la interpretación lineal de nuestros experimentos.

Los cofactores hemo de tipo c de OmcS se modelaron como porfirina de hierro, con los sustituyentes de metilo, tioéter y ácido propiónico del macrociclo reemplazados por átomos de hidrógeno. Los dos residuos de histidina coordinados axialmente se truncaron en el enlace Cb-Cg para dar ligandos de 1-metilimidazol. Este sistema modelo se ha utilizado ampliamente para caracterizar teóricamente las estructuras, los espectros y la reactividad de los cofactores hemo64.

La geometría del modelo de hemo se optimizó al nivel de la teoría funcional de la densidad (DFT) en los estados redox reducidos, oxidados individualmente y doblemente oxidados. Los análisis de frecuencia armónica confirmaron que el modelo de hemo estaba en un mínimo local en la superficie de energía potencial del estado fundamental respectivo para cada estado redox. Las especies reducidas y oxidadas individualmente se optimizaron con la multiplicidad de espín más baja (singlete y doblete, respectivamente). El modelo de hemo doblemente oxidado se examinó en las variedades triplete y singlete. Para las especies oxidadas simple y doblemente en estado fundamental, el valor esperado del operador de espín cuadrado, , fue 0,75 y 2,00 después de la anulación de los contaminantes de espín.

Todas las optimizaciones de geometría y los análisis de frecuencia armónica se realizaron con Becke, tres parámetros, Lee-Yang-Parr (B3LYP) híbrido funcional65 y un conjunto de base mixto, aplicando las funciones de valencia y núcleo efectivo LANL2DZ a Fe66, y el 6-31 G (d) base a los átomos de H, C y N. Al igual que con los cálculos de excitación vertical descritos en la siguiente subsección, empleamos una estrecha convergencia de campo autoconsistente y una cuadrícula de integración ultrafina, como se implementó en Gaussian 16 revisión A.03.

La simulación se realizó en dos tipos de pares de hemo adyacentes, a saber, T-Stack y slip stack presentes en la estructura OmcS (Fig. 1d). Solo los pares de apilamiento deslizante exhibieron transferencia de carga (Fig. 9b complementaria). Por lo tanto, este cálculo se limitó a los hemos vecinos.

El espectro de absorción del hemo en cada estado redox se simuló al vacío con DFT dependiente del tiempo (TD) utilizando el funcional B3LYP y un conjunto de bases 6-31 + G(d) para todos los átomos67,68,69. Los espectros predichos fueron desplazado uniformemente en 38 nm para mejorar la alineación con los espectros experimentales. Los estados de interés excitados, las dos transiciones de Soret, exhibieron cierta contaminación de espín para las especies oxidadas simple y doblemente, que es un problema bien conocido con TD-DFT70. Sin embargo, se desvió solo entre 0,2 y 0,5 del valor no contaminado, y el desplazamiento hacia el azul predicho para las especies doblemente oxidadas en relación con las especies reducidas o oxidadas por separado fue similar independientemente de si se modeló como un singlete de capa cerrada o triplete de caparazón abierto. Por lo tanto, concluimos que el desplazamiento hacia el azul necesario para explicar la observación experimental es independiente de la contaminación por espín presente en nuestros cálculos de capa abierta.

La dinámica de la transferencia de electrones intermoleculares fotoinducida entre hemos adyacentes se modeló con una metodología de propagación de paquetes de ondas descrita anteriormente implementada dentro del marco de Hückel extendido de unión estrecha47. Este nivel de teoría se utilizó anteriormente para describir la estructura electrónica del hierro y otras metaloporfirinas48.

Las estructuras utilizadas tanto para las simulaciones de espectros ópticos como para las simulaciones de dinámica cuántica se proporcionan como Datos complementarios 1.

Los tamaños de las muestras se basaron en convenciones aceptadas dentro del campo para garantizar la reproducibilidad y las estadísticas, y no se realizaron análisis de poder explícitos. No se excluyeron datos del análisis. Todos los experimentos se repitieron de forma independiente varias veces definidas en la leyenda y todos los intentos de replicar los experimentos fueron exitosos. La aleatorización no fue relevante para el estudio, ya que todas las muestras se trataron de manera similar para los estudios a nanoescala o a granel. Los investigadores no estaban cegados a la asignación de grupos durante la recopilación o el análisis de datos, ya que todas las muestras se trataron de manera similar para los estudios a nanoescala o a granel. Las imágenes que se muestran en la Fig. 1b, c se repitieron al menos tres veces. El gel que se muestra en la Fig. 2a se repitió al menos tres veces.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los conjuntos de datos relevantes clave generados y/o analizados durante el estudio actual se incluyen junto con el documento. Todos los demás datos relevantes se incluyen en la Información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Derek Lovley por proporcionar la cepa. También agradecemos a Jason Baxter (Universidad de Drexel) por poner a disposición su espectrómetro TA para mediciones preliminares. Esta investigación fue apoyada por un premio Career Award en Scientific Interfaces de Burroughs Welcome Fund (para NSM), el premio New Innovator del Director de los Institutos Nacionales de Salud (1DP2AI138259-01 para NSM) y el premio NSF CAREER no. 1749662 así como el premio EAGER no. 2038000 (a NSM). La investigación fue patrocinada por la Oficina de Investigación del Ejército (ARO) de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y se realizó bajo el Acuerdo de Cooperación Número W911NF-18-2-0100 (con NSM). Esta investigación también fue apoyada por una subvención de All Points West y un premio NDSEG Graduate Research Fellowship (para CCS). Esta investigación utilizó recursos del Centro de Nanomateriales Funcionales (CFN), que es una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del Departamento de Energía de los EE. UU., en el Laboratorio Nacional de Brookhaven bajo el contrato n. sala limpia del campus y el núcleo de imágenes del campus oeste de Yale.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jens Neu, Catharine C. Shipps.

Departamento de Biofísica Molecular y Bioquímica, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Jens Neu, Catharine C. Shipps, Matthew J. Guberman-Pfeffer, Cong Shen, Vishok Srikanth, Sibel Ebru Yalcin y Nikhil S. Malvankar

Instituto de Ciencias Microbianas, Universidad de Yale, West Haven, CT, EE. UU.

Jens Neu, Catharine C. Shipps, Matthew J. Guberman-Pfeffer, Cong Shen, Vishok Srikanth, Sibel Ebru Yalcin y Nikhil S. Malvankar

Departamento de Química, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Jacob A. Spies, Gary W. Brudvig y Víctor S. Batista

Oxford Instruments Asylum Research, Santa Bárbara, CA, EE. UU.

Nathan D. Kirchhofer

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JN y NSM diseñaron experimentos a granel, mientras que NK, SEY y NSM diseñaron experimentos a nanoescala. JN fabricó electrodos y realizó fs-TA con JAS, JN y CCS midieron la conductividad de nanocables y biopelículas CCS midió espectros UV-Vis, MJG realizó cálculos bajo la supervisión de VSB, CS cultivó biopelículas en electrodos en celdas de combustible microbianas y fabricó electrodos, VS nanocables de proteínas purificadas, NK y SEY realizaron pc-AFM, GWB ayudó con la interpretación de datos y NSM supervisó el proyecto. JNCCS y NSM escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Jens Neu o Nikhil S. Malvankar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Neu, J., Shipps, CC, Guberman-Pfeffer, MJ et al. Biopelículas microbianas como fotoconductores vivos debido a la transferencia ultrarrápida de electrones en nanocables de citocromo OmcS. Nat Comun 13, 5150 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32659-5

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Recibido: 03 Septiembre 2021

Aceptado: 09 agosto 2022

Publicado: 07 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32659-5

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